Pemanfaatan biomassa sebagai sumber energi alternatif merupakan salah satu usaha untuk mengurangi ketergantungan terhadap penggunaan energi minyak bumi yang saat ini masih dipandang sebagai sumber energi utama. Ampas tahu adalah salah satu biomassa yang belum termanfaatkan secara maksimal. Ampas tahu merupakan salah satu biomassa yang memiliki struktur molekul yang kompleks, yang terdiri atas selulosa, hemiselulosa dan lignin. Telah banyak publikasi tentang berbagai teknik pretreatment untuk mengubah struktur fisik dan kimia dari biomassa untuk meningkatkan konversi selulosa pada proses hidrolisis enzimatis. Penelitian ini mempelajari pengaruh pretreatment ultrasonik pada ampas tahu sebelum hidrolisis enzimatis. Penelitian ini dilakukan dengan menggunakan waterbath yang dilengkapi alat ultrasonik (sonikator) dengan frekuensi 20 kHz dan power 5 kW. Dalam penelitian ini dipelajari pretreatment ultrasonik dengan variasi waktu (10, 20 dan 30 menit) dan suhu (60°C, 80°C, 100°C). Ampas tahu yang sudah mengalami pretreatment ultrasonik, selanjutnya dihidrolisis dengan menggunakan enzim selulase dalam reaktor batch dengan volume 100 ml pada suhu 45oC dan pH 5. Pengambilan sampel dilakukan setiap 1 jam selama 6 jam reaksi untuk dianalisis kadar glukosa. Konversi tertinggi pada hidrolisis enzimatis diperoleh pada bahan biomassa dengan pretreatment ultrasonik selama 20 menit.