Pengaruh detoksifikasi dan konsentrasi substrat terhadap produksi hidrogen fermentatif dengan kultur campuran diinvestigasi dalam percobaan batch menggunakan hidrolisat ampas tahu sebagai substrat. Ampas tahu sebagai produk samping industri pengolahan tahu dihidrolisis menggunakan katalis asam encer (0,5% berat HCl, 104°C dan 30 menit). Setelah dinetralkan dengan larutan Ca(OH)2 dan dikenakan perlakuan dengan karbon aktif (1,5% berat/volum), hidrolisat siap digunakan untuk produksi hidrogen. Hasil percobaan menunjukkan, bahwa pada kondisi mesofilik dan pH awal 6,5, produksi hidrogen meningkat dan yield (mmol H2/g gula tereduksi) menurun dengan meningkatnya konsentrasi substrat awal, baik pada system tanpa detoksifikasi maupun dengan detoksifikasi. Yield H2 maksimum 4,9 mmol H2/g gula tereduksi (GT) diperoleh bila hidrolisat tanpa detoksifikasi diinkubasi pada konsentrasi substrat awal 2 g GT/L. Hasil ini 25% lebih tinggi jika dibandingkan dengan substrat yang tanpa detoksifikasi. Proses detoksifikasi hidrolisat menggunakan karbon aktif mempengaruhi kinerja proses fermentasi dengan berkurangnya lama waktu fase adaptasi mikroba (l). Pada konsentrasi substrat 2 g/L, lama waktu fase adaptasi mikroba berkurang dari 20 menjadi 13,25 jam berturut-turut untuk hidrolisat tanpa detoksifikasi dan dengan detoksifikasi.